摘要：病毒是一群体积微小，结构简单，以核酸为中心，以蛋白质为外壳，没有细胞结构的颗粒，并在细胞内寄生的微生物，具有遗传性和变异性。
病毒的种类繁多，常以对人类引起疾病的流行病学和临床特点分为呼吸道病毒，肠道病毒，肝炎病毒，痘类病毒，疱疹病毒等；近年来根据病毒核酸基因又分为含有dna或含有rna的病毒。在人类性传播疾......
摘要：
乙肝后再障属中医“虚劳”、“血证”、“虚损”范畴。其发病原因，现代医学认为是由于肝炎病毒对骨髓造血干细胞的直接毒害作用，以及某些药物对肝脏及骨髓的长期损伤。中医认为是湿热邪毒内陷，日久使造血微环境发生病变，多与肝脾肾有关。如《内经》：“精气内夺则积虚成损，积损成劳”，《类证治裁》：“凡虚损起于脾胃，劳瘵多起于肾经。......
噬菌体展示技术的原理及应用张忠东,成军,中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心,全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市1千39
项目负责人:成军,1千39,北京市,中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心.cj@genetherapy.com.cn 【关注焦点:
春季来临 病毒滋生——当心成年人也会得麻】
张树林,西安交通大学第 一医院传染科陕西省西安市71百61 【健康导读:
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收稿日期:2百2-10-29接受日期:2百2-11-18 【扩展阅读:
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张忠东,成军,张树林.噬菌体展示技术 的原理及应用.世界华人消化杂志2百3;11(4):459-461
0引言1985年smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程 的手段进行改造,将ecorⅰ内切酶 的部分基因片段(171bp与132bp)与pⅲ基因融合,获得 的重组噬菌体可[在]体外稳定增生,表达产物能被抗ecorⅰ内切酶抗体所识别.1988年parmleyetal[2]将已知抗原决定族与pⅲ 的n端融合呈现[在]表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以解抗体识别 的抗原决定簇表位 的设想.1990年mccaffertyetal[3]也报道用噬菌体展示技术筛选溶菌酶 的单链抗体 的方法,从而开始这项技术 的广泛应用 的新时代.
1噬菌体 的基本特征噬菌体属于单链dna病毒,包括f1.fd与m13三类.噬菌体dna[在]细菌内滚环复制,细菌不被裂解,但生长速度减慢,而且可分泌出很多成熟 的噬菌体颗粒.噬菌体 的单链dna长约7千bp,不同类型噬菌体其 一级结构极为相似,基因组编码11种蛋白质,其中5种为结构蛋白,与噬菌体展示密切相关 的是 二种不同 的结构蛋白pⅲ与pⅲ.噬菌体单链dna被包裹[在]大约27百-3千个主要衣壳蛋白pⅲ分子组成 的管状结构中,另外次要衣壳蛋白pⅲ通过与大肠杆菌 的f菌毛结合而引起感染,是 噬菌体感染宿主所必需 的.pⅲ前体由73个氨基酸残基组成,其中信号肽为23个氨基酸残基,根据构成外壳 的功能可分为四个区,6-24氨基酸残基区域占据噬菌体表面 的大部分,25-35氨基酸残基区域高度疏水性,c端(35-50氨基酸残基区域)与dna相结合,构成完整 的内壁,n端(1-5氨基酸残基区域)为可活动 的.外露[在]噬菌体表面 的肽段,是 插入外源基因 的最佳位置.pⅲ前体由424个氨基酸残基组成,形成3-5个拷贝,位于噬菌体 的尾部,他由四个功能区组成,信号肽区(18个氨基酸残基)引导pⅲ至细菌胞间质,[在]pⅲ分泌后被细菌蛋白酶水解,其后 的穿膜区与噬菌体 的侵入有关,受体结合区负责结合f菌毛,而c端 的疏水区组装前黏附[在]细菌内膜上,组装后这段氨基酸序列锚[在]噬菌体外壳上,穿膜区是 最外露 的区域,因而成为插入外源基因 的理想位置.
2噬菌体展示技术 的基本原理噬菌体展示技术是 一种基因表达产物与亲与选择相结合 的技术,他以改构 的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区,使外源多肽或者蛋白质表达并展示于噬菌体表面,进而通过亲与富集法表达有特异肽或者蛋白质 的噬菌体.其建立基于三个原因:(1)[在]pⅲ与pⅲ衣壳蛋白 的n端插入外源基因,形成 的融合蛋白表达[在]噬菌体颗粒 的表面,不影响与干扰噬菌体 的生活周期,同时保持 的外源基因天然构象,也能被相应 的抗体或者受体所识别;(2)利用固定与固相支持物 的靶分子,采用适当 的淘洗(panning)方法,洗去非特异结合 的噬菌体,筛选出目 的噬菌体;(3)外源多肽或者蛋白质表达[在]噬菌体 的表面,而其编码基因作为病毒基因组中 的 一部分可通过分泌型噬菌体 的单链dna测序推导出来.该技术实现基因型与表型 的转换.
噬菌体结构蛋白pⅲ与pⅲ均可作为载体来展示外源多肽或者蛋白质,[在]基因操作上,他们基本相同.[在]信号肽与成熟蛋白质编码区之间有单 一 的克隆位点便于插入,插入 的外源多肽或者蛋白质以融合 的形式表达出来并分泌到胞间质内,当宿主蛋白酶切除信号肽后,融合蛋白组装成熟,呈现[在]病毒粒子 的表面,新 的n端位置正是 外源蛋白或者多肽 的插入点.与pⅲ基因融合时拷贝数低(不超过5个),这可以减少多价结合,利于选择高亲与力 的配体分子,可容许插入大 的片段.与pⅲ基因融合时,拷贝数高(27百个),当将属于多肽 的表位用作免疫源时可产生良好 的免疫应答,具有反应优势,故[在]疫苗开发上具有潜[在] 的应用价值.
亲与筛选可用直接法与间接法.直接法是 将蛋白质分子耦联到固相支持物上,文库噬菌体与固相支持物温育,洗去未结合 的噬菌体,既获得亲与噬菌体;间接法是 将生物素标记 的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺[在]结合有链亲与素 的平皿上,洗去未结合 的噬菌体,保留 的就是 结合状态 的噬菌体,再洗脱结合 的噬菌体,用这部分噬菌体感染细菌,扩增噬菌体,开始新 一轮 的筛选,通过几次这样 的亲与纯化反应,就能选择性地富集并特异性扩增结合这种蛋白质或者dna分子 的噬菌体.筛选出 的噬菌体 的结合特性可以进 一步验证并从dna序列推导出来,分析各个克隆间编码短肽 的 一致序列,以确证筛选 的特异性.最后,利用化学合成含 一致序列 的氨基酸短肽,研究他们 的亲与特性并推测可能配体 的生物学活性与结合或者游离状态 的结构特点.
3噬菌体展示技术 的应用
3.1噬菌体随机多肽文库肽库是 感染性噬菌体 的集合,其中平均每个病毒粒子 的衣壳表面都含有以融合蛋白形式显露 的唯 一 的核苷酸顺序编码寡肽,通过选择步骤可以富集与靶分子结合 的噬菌体.构建随机多肽文库 一般先体外合成编码短肽 的随机dna片段,经pcr扩增或者杂交使其形成携带适当酶切位点 的基因片段,或者经pcr扩增某特定基因后再用dnaseⅰ酶解,使其形成长短不 一 的小基因片段.随机肽库 的应用范围依采用 的筛选分子而言,这些筛选分子包括抗体.小分子.细胞表面受体类.细胞分子类.完整细胞等,这些分子称为受体类.筛选出 的结合该类受体 的目 的分子称为配体.用纯化 的单克隆抗体作受体,进行抗体 的表位分析应用最广泛也最成熟,筛选出 的配体通常表明抗原抗体 的结合部位.blond-elguindietal[4]采用甲胎蛋白(afp)洗脱 的策略筛选出bip结合短肽 的共有序列,阐明bip识别与蛋白质折叠 的机制.用细胞表面 的天然受体作筛选分子是 筛选技术 的 一大进步,doorbaretal[5]采用竞争洗脱 的方法筛选出细胞表面受体特异性结合 的短肽,pasqualinietal[6]成功地筛选出肠与胃组织特异性 的短肽,预示有可能用于体内基因 的定向转移.噬菌体展示技术也可以用于病毒 的诊断.治疗与疫苗 的发展,folgorietal[7]以乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)为模型,用乙型肝炎患者特异性血清筛选肽库,用免疫印迹鉴定噬菌体表位,用正常人血清反向筛选,最终得到 的短肽可模拟hbsag并由竞争结合试验验证.mottietal[8][在]对hbv 的研究中,用抗病毒单克隆抗体筛选出模拟表位,免疫后可引起机体特异性 的对hbsag 的机体免疫,提示模拟短肽可用于疫苗 的发展.arnonetal[9]用八肽随机肽库筛选曼氏血吸虫 的模拟表位,认为模拟表位可以作为多肽疫苗 的重要成分.利用肽库技术确定沙眼衣原体主要外壳蛋白 的表位[10].hcv核心抗原表位[11].hivgp120蛋白与hcv核心蛋白 的表位[12].利用噬菌体肽库技术已经确定很多蛋白分子 的相互作用位点,包括组成 的sh3与酪氨酸蛋白激酶 的结合位点[13].胞质蛋白p47phox与细胞色素b558 的结合位点[14].用亲与纯化 的hla-dr13从噬菌体肽库中钓出与之结合 的多肽,通过mhc与多肽 的结合基序分析mhc-i分子 的结合特点[15].wrightonetal[16]筛选到具有促红细胞生成素(epo)功能活性 的由二键连接 的环形短肽.他用重组可溶性红细胞生成素受体(epo-r)先筛选与gp120融合表达 的构象约束型噬菌体八肽库,得到与epo-r特异性结合,且不与牛血清白蛋白(bsa).肿瘤坏死因子受体(tnfr) 的胞外区.神经生长因子受体(ngf-r).白介素-2受体(il-2r) 的a与b亚基以及e选择素结合 的环肽[16].
3.2噬菌体抗体库噬菌体抗体库技术利用丝状噬菌体载体构建抗体文库,通过已知抗原筛选特异性高亲与性抗体 的技术.mccafferyetal[3]首先证明,完整 的抗体可变区可表达于噬菌体 的表面,通过亲与筛选获得与已知抗原特异性结合 的单链抗体片段,hogrefeetal[17]又从构建 的fab文库筛选到特异 的fab片段.
平均每种抗体 的可变区由超变区与骨架区(fr)组成,超变区又称互补决定区(cdr)决定抗原 的结合位点,其氨基酸序列变异较大,而连接超变区 的骨架区很保守.噬菌体抗体库运用三项实验技术:(1)逆转录多聚酶链反应(rt-pcr)技术,用 一种引物克隆出全套免疫球蛋白可变区基因;(2)采用大肠杆菌分泌表达具有生物活性 的抗体功能片段;(3)噬菌体表面展示技术 的建立,其主要技术流程是 ,从免疫或者不经免疫 的人与小鼠 的脾淋巴细胞中提取mrna,反转录成cdna,使用与抗体可变区基因两侧保守区互补 的引物,通过多聚酶链反应(pcr)分别扩增抗体可变区 的重链(vh)与轻链(vl)基因,构建文库.插入噬菌体载体后有二种表达模式,即表达scfv单链抗体或者fab抗体,scfv由vh与vl之间通过人工接头相连;而fab片段 的vh+ch1与vl+cl分别插入不同 的噬菌体载体,二种重组噬菌体超感染同 一宿主菌,vl+cl就可与vh+ch1片段通过二硫键结合形成fab片段.将噬菌体抗体文库通过特异性抗原 的筛选,就可以得到含特异性抗体片段 的噬菌体.
噬菌体抗体库技术模拟机体免疫系统 的选择作用,呈现[在]噬菌体表面 的抗体能够[在]体外用固相化抗原进行筛选,同时由于噬菌体对大肠杆菌 的感染性,噬菌体抗体库技术能够以淘筛 的方式,为快速选择特异性抗体提供简便而高效 的操作系统,具体 的步骤:(1)噬菌体黏附靶抗原.(2)反复洗涤去除非特异性结合,洗脱并收集与抗原结合 的噬菌体.(3)再次感染大肠杆菌,使特异 的噬菌体抗体淘筛.除此之外,也有用固相淘筛.捕获淘选.完整细胞淘筛....
下一页 摘要：
国家人口计生委科学技术研究所邹燕等,通过计算机检索中国生物医学文献数据库等9种数据库,手工检索《生殖医学杂志》等10种杂志,系统评价了米非司酮配伍米索前列醇进行药物终止妊娠的有效性。(中国循证医学杂志2005,5:619)
评价者共纳入药物终止妊娠与手术终止妊娠比较的原始研究8篇(3348例),同种药物不......
